7.5.2.2. Kháng bệnh Các tế bào đơn hoặc protoplast phân lập được nuôi cấy dưới tác dụng của các tác nhân gây đột biến vật lý hoặc hóa học để cảm ứng cho tính kháng phytotoxin. Carlson (1973) tái sinh cây từ protoplast thuốc lá được xử lý ethylmethane sulphonate (EMS)-chọn lọc cho tính kháng methionine sulphoximide (MSO)-nhận thấy tính chống chịu tăng lên đối với Pseudomonas tabacci. Tính kháng được di truyền như một tính trạng đơn nửa trội (single semi-dominant trait). Gegenbach và Green (1975-1977), chọn lọc tính kháng T-toxin của Helminthosporium (độc tố đặc trưng vật chủ) ở nuôi cấy in vitro ngô, đã thu được dòng ngô bất dục đực có khả năng kháng bệnh rỉ sắt do nấm Helminthosporium maydis gây ra bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào nuôi cấy bằng phương thức sau: Sơ đồ 7.2. Chọn dò̀ng khá́ng Helminthosporium maydis ở̉ ngô Kháng độc tố của nấm bệnh rỉ sắt và tính bất dục đực di truyền đường mẹ do đột biến trong một gen gây nên, hoặc do trong tế bào chất có cả một quần thể genome của các cơ quan tử, chọn lọc tính chịu bệnh tức là chọn gen thích hợp trong quần thể đó. Tính kháng thường do mtDNA quyết định, và tính bất dục đực trong trường hợp này cũng do mtDNA quyết định. Ở thuốc lá, người ta chọn lọc được đột biến kháng methionine sulfoximine, độc tố do Pseudomonas tabacci tiết ra (P. tabaci gây bệnh cháy rụi ở thuốc lá). 7.5.2.3. Kháng chất diệt cỏ Sinh trưởng của cỏ dại trong quần thể các cây trồng quan trọng trong nông nghiệp thường được điều chỉnh bằng các chất diệt cỏ. Vì các chất diệt cỏ (herbicide) có thời gian sống dư ngắn (short residual life), nên chúng được ứng dụng lặp lại nhiều lần trên cây trồng. Một số cây trồng đã trở nên nhạy cảm với chất diệt cỏ do việc sử dụng lặp lại của nó trên cây. Hơn nữa, phương pháp điều chỉnh cỏ dại như thế này là không kinh tế vì các chất diệt cỏ hầu hết là đắt tiền. Phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép thu được các cây biểu hiện tính chống chịu đối với các chất diệt cỏ. Nuôi cấy protoplast trên môi trường có các chất diệt cỏ khác nhau đã cảm ứng đột biến tạo các dòng tế bào chống chịu sau đó có thể tái sinh thành cây. Các cây kháng các chất diệt cỏ tái sinh từ tế bào nuôi cấy bao gồm Nicotiana tabacum (kháng amitrole, bentazone, chlorosulphon, isopropyl N-carbamate, phenmedifarm, picloram và paraquat), Corydyllis (kháng glyphosphate), và Medicago sativa (kháng glufosinate). Một số tính trạng chống chịu được di truyền như là các đơn allele (monogenic alleles) trội hoặc lặn (Bảng 7.2). Khả năng chống chịu chất diệt cỏ cũng có thể được biến nạp vào tế bào bằng cách lai soma (xem chương 5) hoặc thông qua công nghệ chuyển gen (xem chương 6). Bảng 7.2. Các dòng tế bào đột biến mang tính trạng hữu ích trong nông nghiệp thu được từ nuôi cấy in vitro. Tác nhân chọn lọc Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây 1. Chịu lạnh Daucus carota Nicotiana sylvestris EMS Không Có(e) Có 2. Kháng các chất diệt cỏ Asulam Apium gravaeolens Không Không Bentazone Nicotiana tabacum (1n) Tia Có(c) 2,4-D Lotus corniculatus Không Có 2,4-D; 2,4,5-T; 2,4-DB Trifolium repens Không Không Isopropyl-N-phenyl-carbamate Nicotiana tabacum EMS Có(c, d) Paraquat Nicotiana tabacum Tia X Có(c) Phenmedifarm Nicotiana tabacum (1n) Tia Có(c) Picloram Nicotiana tabacum Không Có(c) 3. Kháng các pathotoxins Fusarium oxysporum Solanum tuberosum Không Có Helminthosporium maydis Zea mays T-cms Không Có(c) Phytophthora infestans Solanum tuberosum Không Có(c) 4. Chống chịu muối Capsicum annum Datura innoxia Kickxia ramosissima Medicago sativa Oryza sativa Nicotiana sylvestris Nicotiana sylvestris Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Không Không Không Không Không Không Không EMS Không Không Có Có Không Không Không Không Có Có(c) Chú thích (c) Cây kháng. (d) Cây bất thụ. (e) Không biểu hiện trong cây. 7.5.2.4. Chống chịu các stress của môi trường Stress của môi trường do nồng độ muối cao ở trong đất là nhân tố chính kìm hãm phát triển nông nghiệp. Từ kết quả đầu tiên là tái sinh cây thuốc lá in vitro chống chịu NaCl (Nabors 1980), đến nay người ta đã phát triển một số lượng lớn các dòng tế bào và cây trồng có thể chống chịu nồng độ muối cao (Nguyễn Hoàng Lộc 1992). Dix (1977) đã phát triển các dòng chống chịu lạnh bằng cách nuôi cấy tế bào của Nicotiana sylvestris ở điều kiện nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, phenotype của các cây tái sinh từ những dòng này không được chuyển sang thế hệ sau bằng phương thức hữu tính. Lê Trần Bình (1992) cũng đã thu được các dòng lúa chịu nhiệt độ thấp thông qua nuôi cấy mô callus. Các kết quả tương tự theo hướng biến dị dòng soma mang tính trạng chống chịu stress nước được cảm ứng bằng PEG hoặc mannitol (mannitol or PEG-induced water stress) trong nuôi cấy mô callus thuốc lá, mía và lúa cũng đã được thông báo (Nguyễn Hoàng Lộc 1992, 2003; Razdan 1994; Trương Thị Bích Phượng 2004). 7.5.2.5. Các dòng khuyết dưỡng Các dạng khuyết dưỡng được sử dụng cho biến nạp DNA, lai soma và nghiên cứu các quá trình trao đổi chất. Sử dụng nuôi cấy tế bào đơn bội và xử lý đột biến gen tiện lợi cho phát triển một số lớn các loại khuyết dưỡng. Các dòng tế bào khuyết dưỡng đầu tiên được Carlson (1970) thông báo là cây thuốc lá đơn-nhị bội (dihaploid) sinh trưởng chậm trên môi trường tối thiểu và đòi hỏi sự trao đổi chất đặc biệt để hồi phục lại sự sinh trưởng bình thường. Các dòng khuyết dưỡng phân lập được trong nuôi cấy in vitro các loài thực vật khác nhau bao gồm các yêu cầu: (a) pathotenate, adenin và isoleucine + valine ở Datura innoxia; (b) histidine, tryptophan và nicotinic acid ở Hyoscyanus muticus; và (c) isoleucine, leucine, và uracil ở Nicotiana plumbaginifolia. Các dòng Datura được phân lập trong nuôi cấy dịch huyền phù tế bào. Thông qua dung hợp bổ sung (fusion-complementation), các dòng khuyết dưỡng của N. plumbaginifolia và H. muticus được xác định là ở trạng thái lặn. Chlorate ( )-một dạng tương tự nitrate-được biến đổi nhờ enzyme nitrate reductase trở thành chlorite ( ), một loại độc tố của tế bào. Vì vậy, ở môi trường được bổ sung chlorate các tế bào dạng hoang dại có hoạt tính của enzyme nitrate reductase sẽ bị chết, trong khi các tế bào không có enzyme này sẽ sống sót. Các thể hồi biến (revertants) của dạng hoang dại có thể được kiểm tra bằng khả năng sử dụng trong môi trường nuôi cấy của các tế bào này. Các dòng thiếu nitrate reductase được phân lập từ các tế bào nuôi cấy của N. tabacum, N. plumbaginifolia, H. muticus, D. innoxia, Rosa damascena và Petunia. Người ta có thể sử dụng các loại dòng tế bào và các đặc tính của chúng như những đặc điểm chỉ thị trong nghiên cứu điều khiển di truyền và kỹ thuật gen. Hai loại dòng tế bào như thế đã được xác định: một loại là đột biến (nia) không tổng hợp apoenzyme, trong khi loại kia (cnx) không tổng hợp cofactor. Các phenotype này được sử dụng như là các marker bổ sung trong việc chọn lọc các thể lai soma. Sơ đồ 7.3. Dòng cnx và nia về gen NR trong thuốc lá. Bảng 7.3. Các đột biến khuyết dưỡng chọn lọc được trong nuôi cấy in vitro. Nhu cầu dinh dưỡng/ kiểu hình Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây Adenine Datura innoxia (1n) EMS Không p-aminobenzoic acid Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Arginine Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Biotin Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Histidine Hyoscyamus muticus (1n) NTG Có Hypoxanthine Nicotiana tabacum (1n) EMS Có 7.5.2.6. Kháng kháng sinh (antibiotic resistance) Maliga (1973) chọn lọc thành công dòng tế bào thuốc lá kháng streptomycin di truyền đường mẹ. Streptomycin ức chế sinh tổng hợp protein ở lục lạp, ty thể nhưng không ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein trong ribosome tế bào chất. Dòng tế bào kháng streptomycin có màu xanh được chọn bằng cách tách những cụm tế bào xanh trên môi trường chứa streptomycin. Dòng tế bào có màu trắng được chọn thông qua khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa streptomycin. Khả năng kháng này có thể do cả lục lạp và ty thể nhưng cũng có thể chỉ do một cơ quan tử quyết định. Ngoài ra, người ta còn phát hiện được tính kháng tổ hợp nghĩa là chọn lọc tính kháng một loại kháng sinh này nhưng cũng kháng được một số kháng sinh khác. Ví dụ: dòng N. sylvertris kháng kanamycin vẫn có thể kháng được streptomycin và neomycin. 7.5.2.7. Kháng các đồng đẳng base của DNA Trong nuôi cấy mô tế bào động vật người ta dùng: 5-bromodeoxy uridin (BUdR) và 8-azaguanidin (AG) để chọn những dòng tế bào đột biến thiếu thymidinkinase (TK) và hypoxanthin guanidin phosphoribosyl transferase (HGPRT). Cơ chế chọn lọc đó như sau: - Các tế bào có TK và HGPRT bình thường sẽ sử dụng BUdR và AG như các nucleotide cho sinh tổng hợp DNA. DNA mang BUdR và AG sẽ không bình thường và tế bào sẽ chết. - Những tế bào thiếu TK và HGPRT không sử dụng BUdR và AG chúng sẽ sống được. Các nhà nuôi cấy mô thực vật cũng sử dụng mô hình này đối với tế bào thực vật và bước đầu thu được một số kết quả. Ví dụ: chọn được dòng tế bào thuốc lá có hoạt tính HGPRT giảm 50%, song các dòng kháng BUdR vẫn có hoạt tính enzyme lại phụ thuộc TK khá lớn. Điều đó được giải thích như sau: trong tế bào thực vật có hai loại TK, như vậy phải chọn được hai tế bào đột biến đồng thời mới mất hoàn toàn hoạt tính TK. Mặt khác dòng tế bào đậu tương kháng BUdR của Okyana (1976) lại do tế bào có khả năng sản xuất dư thừa thymidin. Cũng thể có tế bào có cơ chế sửa chữa DNA tốt cho phép chúng sửa được những sai lệch do BUdR hay AG gây ra và như vậy chúng có khả năng kháng BUdR và AG. 7.6. Nuôi cấy tế bào trong sản xuất các hợp chất tự nhiên 7.6.1. Phương hướng chiến lược trong sản xuất các sản phẩm thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào Mặc dù trong nhiều trường hợp các hợp chất có giá trị chữa bệnh hoàn toàn thu được hoặc được sản xuất nhưng với hàm lượng rất nhỏ thì người ta vẫn có thể tổng kết chung được rằng: Mỗi tế bào đều có khả năng biểu hiện tính toàn thể hóa học cũng như hình thái học. Một vài ví dụ chứng minh cho chiến lược chung mà chúng ta cần phải tuân theo để có thể có được các dòng tế bào có năng suất cao. Đầu tiên là cấy gây nuôi cấy tế bào của loài thực vật sản sinh ra hợp chất chúng ta cần có (nên chọn loài có năng suất cao) và sau đó tiến hành chọn tính ổn định của những dòng tế bào khác nhau từ những cơ thể khác nhau để tìm ra dòng có năng suất cao. Theo phương thức này những dòng tế bào có năng suất alkaloid cao được chọn từ nuôi cấy mô của Catharanthus hoặc những dòng tế bào với hoạt tính hydroxyd hóa cao được chọn từ nuôi cấy của cây Digitalis. Tuy nhiên, những dòng tế bào Digitalis này cho đến thời điểm hiện tại vẫn không sản sinh ra cardiac glycoside. Kỹ thuật chọn dòng này cũng đã được ứng dụng để chọn ra dòng tế bào sản xuất ra nhiều nicotin từ một dòng tế bào của Nicotiana rustica đã mất hoàn toàn khả năng tổng hợp alkaloid. Phương pháp chọn dòng này đã được cải tiến bằng cách kết hợp với những phương pháp phân tích có độ nhạy và tính đặc thù cao hơn, ví dụ miễn dịch phóng xạ. Mặc dù đó không phải là tiền đề cần thiết trong mỗi trường hợp. Đương nhiên, con đường tối ưu nhất vẫn là tìm ra được những phương pháp cho phép xác định những sản phẩm thứ cấp ở ngay trong tế bào sống, chẳng hạn thông qua các chất huỳnh quang UV hay chất có màu sắc nhận thấy được. Thế nhưng trong thực tế rất khó tìm ra chất màu có khả năng thâm nhập vào không bào là nơi các sản phẩm thứ cấp được tích trữ để vẫn tạo ra phản ứng màu mà không làm chết tế bào. Sự phân lập các dòng tế bào chịu p-fluorphenylalanine, trong đó có một dòng có hoạt tính enzyme tăng lên và hàm lượng cao các hợp chất fenol tan trong etanol cho thấy một triển vọng khác trong việc chọn dòng tế bào. Đó là cách sử dụng các chất đặc biệt gây áp lực chọn lọc để phân lập những tế bào sản xuất dư thừa các sản phẩm thứ cấp thực vật điều đó có thể kiểm nghiệm với những nuôi cấy tế bào tạo alkaloid có nguồn gốc là các acid amin. Tuy nhiên, người ta cần thấy rằng việc sản xuất các amino acid đặc thù này không phải là yếu tố hạn chế duy nhất đối với quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp trong tế bào mà ở đây còn có nhiều yếu tố khác cần đề cập tới. Một bước tiếp theo là phải cải tiến qui trình nuôi cấy bằng cách thay đổi hợp lý môi trường, cũng như nhiều tài liệu đã thông báo người ta thay đổi hàm lượng hormone, đường, vitamin, nhiệt độ... Hàng loạt những biến đổi môi trường, điều kiện nuôi cấy hoặc thay đổi cả dòng tế bào cũng mới chỉ được kiểm nghiệm trong hệ thống kiểm định như phương pháp giọt nhỏ kết hợp với phương pháp miễn dịch phóng xạ. Nghiên cứu thay đổi môi trường nuôi cấy được cải tiến thêm một bước khi kỹ thuật nuôi chemostat (thể ổn định hóa tính) được ứng dụng. 7.6.2. Nuôi cấy tế bào năng suất cao Nuôi cấy tế bào của nhiều cây dược liệu đã được tiến hành nhưng trong nhiều trường hợp người ta không tìm thấy hoặc thấy với lượng rất nhỏ (dạng vết) các hợp chất muốn có. Tuy nhiên, tới nay thực tế đã cho thấy có những thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp thực vật với hàm lượng lớn hơn cả hàm lượng của các chất đó ở chính những bộ phận thực vật có nhiệm vụ tích trữ các hợp chất đặc biệt này. Nuôi cấy đầu tiên được phân lập có chứa hàm lượng cao các sản phẩm thứ cấp đó là các nuôi cấy sản xuất ra các hợp chất sắc tố như anthocyanin trong tế bào Haplopappus, betalain trong callus của củ cải đường hoặc anthraquinon trong tế bào của Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia và các loài Galium. Trong trường hợp của cây Morinda và Galium, người ta đã nâng được hàm lượng anthraquinon trong nuôi cấy tế bào lên 20 lần so với rễ là cơ quan tích trữ các hợp chất này của các cây nói trên. Kể cả khi người ta so sánh hàm lượng các chất trong tế bào và là tế bào chuyên sản sinh ra các chất đó thì hàm lượng ở tế bào nuôi cấy vẫn lớn hơn từ 2-4 lần. Hàm lượng tương đối cao của ubiquinon-10 được tìm thấy trong tế bào thuốc lá và L-dopa trong môi trường nuôi cấy tế bào Mucuna pruriens. Nhiều công trình cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thường. Người ta đã phân lập được các dòng tế bào Catharanthus sản xuất serpentin ajmalicin từ nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt họ đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tốt nhất lên một mức cao hơn nữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalicin. Cũng rất đáng chú ý là nuôi cấy tế bào cây Panax pseudoginseng cho hàm lượng saponin khá cao và nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza glabra đạt được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô. Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được xác định trong nuôi cấy tế bào của cây Coleus blumei, đó là 13-15% trọng lượng khô chất rosmarinic acid trong chu kỳ nuôi 13 ngày. Nồng độ rosmarinic acid trong tế bào nuôi cấy lớn hơn năm lần so với trong cây. Trên lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid các dòng tế bào có năng suất cao đã được nghiên cứu. Một số công trình đã nuôi cấy thành công tế bào của cây Dioscorea deltoidea với sản lượng diogenin là nguyên liệu thô chính để sản xuất các steroid chống thụ thai và các hormone thượng thận. Quá trình chuyển hóa các steroid được khá nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu. Chẳng hạn, nghiên cứu quá trình sinh chuyển hóa các hợp chất glycoside cardiac bằng nuôi cấy tế bào của Digitalis lanata mặc dù tế bào Digitalis lanata ngừng sản xuất glycoside cardiac nhưng chúng vẫn có khả năng hydroxyd hóa digitoxin ở nguyên tử C12 để tạo ra digoxin. Digoxin là một hợp chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa xảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu quả khi đưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày người ta thu được 4 g β-methyl-digoxin trong một bình nuôi dung tích 20 lít. Ngoài ra, người ta còn có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây Coffea arabica, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberin trong rễ, song hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)... Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghệ hương liệu và trong y học. Chất reserpin là chất có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn khác cũng được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào cây này trong 30 ngày có thể sản xuất được 3500 kg reserpin, tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó. Chất naptathoquinones chiết từ rễ cây cỏ rễ máu (puccoon) được dùng để chữa bỏng và bệnh ngoài da. Chất này cũng được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, sản lượng chất này được tạo ra từ mô nuôi cấy cao hơn tám lần so với cây tự nhiên. Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ) đã sản xuất được loại alkaloid scopolanin từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy. Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn dòng và kỹ thuật gen, người ta đã làm tăng sản lượng scopolamin gấp ngàn lần. Tóm lại, nuôi cấy mô và tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp với năng suất cao và trong một vài trường hợp cao hơn hẳn so với những cây hoàn chỉnh có năng suất cao nhất. Bảng 7.4. Sự tích lũy các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô và tế bào Các chất trao đổi thứ cấp Loại nuôi cấy Nguồn thực vật - Anthocyanins Cyanidin C Dimorphothica auriculata C Haplopappus gracilis Delphinidin C D. auriculata - Anthraquinones Alizartin C Morinda citrifolia Digitolutein C Digitalis lanata 4-hydroxydigitolutein C D. lanata 3-methyl purpurin C D. lanata Rhein C Cassia angustifolia - Carotenoids Antheraxanthin Beta-carotene Lutein Lutein-5, 6 epoxide Neoxanthin Voilaxanthin Zeaxanthin C Ruta graveolens - Chalcones and Deoxyflavones Daidzein C, SC Phaseolus aureus C, SC Glycine max 2’,4,4’-trihydroxy chalcone C P. aureus - Coumestanes và Coumarino chromans Coumestrol C, SC P. aureus Pisatin C Pisum sativum Soyagol C, SC P. aureus - Flavones và Flavanoids Apigenin SC G. max C Solanum dulcamara C Trigonella corniculata Artimissinine C Artemisia scoparia Chrysoerion SC Petroselinum hortense Isorhamnetin SC Argemone mexicana SC P. hortens Keempferol C C C C C C C Agave wightii Allium sativum A. scoparia Dolichos lablab G. max P. sativum Lycopersicon esculentum Luteolin C SC Datura pinnata Papaver hortense Negretin SC Solanum tuberosum Nobeletin C Citrus aurantinum Quercetin C SC C C C C C A. wightii Crotalaria juncea Datura metel D. taluta L. esculentum P. hortense S. aviculare Sinensetin C C. aurantium - Naphthoquinones Plumbagin C Plumbago zeylanica - Sapogenins Chlorogenin Hecogenin Sarsasapogenin Smilagenin Tiggenin C Yucca aloifolia Diosgenin C C C C S. aviculare S. dulcamara S. nigrum S. xanthocarpum Gitogenin C A. wightii Hecogenin C A. wightii Tiggenin SC S. nigrum - Sesquiterpenes Cryophyllenebisabolene SC C Andrographis paniculata Lindra strychinifolia Lindenenol C L. strychinifolia Linderane L. strychinifolia - Steroidal alkaloids Solasonine C S. xanthocarpu Tomatin C L. esculentumm - Sterols và Triterpenes Beta-amyrin C C Paul’s Scarlet Rose Tylophora indica Beta-sitosterol C Nicotiana tabacum Campesterol C C Withania sommifera D. metel C C C C Helianthus annuus Paul’s Scarlet Rose Trigonella indica T. foenum-graceum Cholesterol C, SC C, SC H. annuus S. indicum Cycloartinol C, SC N. tabacum Isofucosterol C, SC H. annuus Lanosterol C S. nigrum Obtusifoliol C, SC N. tabacum Stigma sterol C Dioscorea tokora - Tannins Catechin C SC Camellia sinensis Paul’s Scarlet Rose Epicatechin C C. sinensis Chữ viết tắt C: callus, SC: nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) 7.6.3. Sản xuất bằng nuôi cấy tế bào ở những nước công nghiệp Kỹ thuật tiến bộ về nuôi cấy tế bào đang được triển khai ngày càng rõ ràng ở các nước công nghiệp tiên tiến. Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Shikonin cũng là một vị thuốc dân tộc Nhật Bản dùng làm thuốc chống viêm. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, có năm vấn đề quan trọng hạn chế kỹ thuật nuôi cấy tế bào cho mục tiêu thương phẩm đối với một số chất có giá trị cao: - Chọn được dòng thực sự có năng suất cao. - Điều khiển được tế bào tạo ra chất quan tâm. Gen mã hóa các sản phẩm hóa học đó thường chỉ hoạt động ở những điều kiện rất đặc biệt. - Nhiễm khuẩn và nhiễm nấm vì tế bào thực vật sinh trưởng chậm, xử lý kháng sinh cũng gây ra hậu quả cho sinh trưởng và tạo hoạt chất. - Sản phẩm không tập trung vì tế bào thực vật không tổng hợp chuyên một sản phẩm thứ cấp mà thường là kèm một số chất khác nữa. - Nuôi cấy tế bào thay đổi vì những biến động trong tương tác các gen khác nhau và dòng năng suất kém có thể lấn át toàn bộ nuôi cấy. Mặc dù vậy, những đột phá trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào (ví dụ nuôi cấy rễ tơ) cho thấy trong tương lai gần bất cứ hóa chất công nghiệp nào có nguồn gốc thực vật cho dù đó là dược liệu, thuốc nhuộm hay chất màu thực vật đều có thể sản xuất trong các nồi phản ứng sinh học. 7.6.4. Nuôi cấy rễ tơ (hair roots) và sinh tổng hợp Những vấn đề tồn tại trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ, cơ sở khoa học của giải pháp này là việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh trưởng của rễ hoạt động. Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng rất ổn định về di truyền, sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm trong đó đáng kể là khả năng tránh nhiễm khuẩn. Các công ty Nhật Bản đã sử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn. Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể sản xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng. Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn gốc thực vật đang được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ. Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư. Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng hợp để thu được một chất có cấu trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải. Công ty dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất. Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system) nhằm chứng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6 ngăn (six-well polystyrene plates) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc 120 vòng/phút). Merkli và cs. (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất-McCown’s woody plant medium có 1% sucrose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Sevón và cs. (1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34 cây riêng rẽ đã trưởng thành. Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin, và điều đáng kể là đã tìm thấy các biến dị dòng soma trong các cây này. Tuy nhiên, sự có mặt của các gen rol (A, B và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ. Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion ( , , , K+, Ca2+ và Mg2+) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine. Nồng độ và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao nhất khi và K+ cao. 7.7. Ứng dụng của biến dị dòng soma và dòng giao tử trong công tác giống cây trồng Các đột biến đơn gen trong hệ gen của nhân hoặc cơ quan tử có thể tạo ra một thứ in vitro (in vitro variety) thích hợp nhất có các đặc tính đặc trưng được cải thiện. Trong khuôn khổ tạo giống cây trồng, biến dị dòng soma có thể được sử dụng để khám phá ra các thể biến dị mới duy trì tất cả các đặc tính tốt và có bổ sung tính trạng hữu ích, như kháng các bệnh hoặc chất diệt cỏ. Các biến dị này sau đó có thể được thử nghiệm trên đồng ruộng để xác định chắc chắn sự ổn định di truyền của chúng. Lai thuận nghịch (reciprocal cross) giữa thế hệ F1 mang tính trạng mong muốn với đối chứng có nguồn gốc từ hạt sẽ ổn định xa hơn (further stabilise) các thể biến dị và giúp đỡ tạo hạt giữa các dòng hứa hẹn. Biến dị dòng giao tử, được cảm ứng hầu hết bởi sự tái tổ hợp giảm phân trong chu trình hữu tính của thể lai F1, tạo ra sự phân ly vượt quá giới hạn để khám phá ra các tổ hợp gen duy nhất. Các dòng tế bào khác nhau chọn lọc trong điều kiện in vitro có thể chứng minh năng lực ứng dụng cho nông nghiệp và công nghiệp. Các cây tái sinh biểu hiện các tính trạng kháng chất diệt cỏ, pathotoxin, muối hoặc phèn. Hơn nữa, khả năng biến dị trong nuôi cấy tế bào đã thể hiện một vai trò hữu ích trong việc tổng hợp các chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thương mại. Hinh 7.2 Biểu đồ khai thác hiệu quả tác động giữa nhân và tế bào chất Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma và dòng giao tử dễ dàng hơn công nghệ DNA tái tổ hợp. Đặc biệt, cải thiện cây trồng mang các tính trạng đa gen (polygenic traits) bằng các phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống và không truyền thống đã được chứng minh là rất khó khăn. Biến dị dòng soma có thể là một kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền các cây trồng này. 7.8.Thực hành nuôi cấy dịch huyền phù 1. Nguyên liệu thực vật - Hạt lúa (Oryza satica): nuôi cấy tạo callus. - Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria) in vitro: nuôi cấy tạo callus. 2. Môi trường nuôi cấy tạo callus a. Lúa - MS đầy đủ - Saccharose 3 % - Agar 0,8 % - 2,4-D 5 mg/L - KIN 0,1 mg/L - pHmôi trường ~ 5,8 3. Môi trường nuôi cấy tế bào dịch lỏng Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus nhưng không bổ sung agar. 4. Tiến hành * LÚA: chuẩn bị môi trường theo các bước tương tự các bài trước. - Tạo callus Hình 7.3. Nuôi cấy tạo mô sẹo lúa Hạt lúa bóc vỏ, rửa sạch bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Cho hạt lúa vào bình khử trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút. Sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1 % trong 6 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần trước khi cấy. Cấy hạt lúa đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux . Sau 4-5 tuần các callus màu trắng sữa xuất hiện trên các hạt lúa. - Nhân callus Dùng dao mổ tách lấy các khối callus nhỏ có đường kính 1-2 mm cấy chuyển lên môi trường nhân callus (thành phần môi trường tương tự như môi trường tạo callus). Sau 3-4 tuần, các callus sẽ phát triển nhanh chóng thành các khối callus lớn (đường kính khoảng 3-5 mm). - Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch huyền phù. Các bước tiến hành và khử trùng tương tự môi trường có agar. Mỗi bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường. Chọn các khối callus có màu trắng ngà, rắn từ môi trường nhân để chuyển vào môi trường lỏng. Một gam callus cho vào 1 bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường (các thao tác tiến hành trong điều kiện vô trùng). Đặt các bình môi trường chứa callus trên máy lắc ở trong phòng nuôi cấy (nhiệt độ 25 ± 2oC) với tốc độ khoảng 100-150 vòng/phút Cứ 2 ngày lấy ra một bình nuôi cấy, lọc sinh khối tế bào bằng máy hút chân không, cân lượng mẫu tươi thu được. Sau đó, đem sấy mẫu ở 65oC trong 2 giờ để cân trọng lượng khô. So sánh với kết quả ban đầu để theo dõi tốc độ sinh trưởng của callus
Posted on: Wed, 18 Sep 2013 14:57:50 +0000
Trending Topics
Recently Viewed Topics
© 2015