TÓM TẮT ĐỀ TÀI Thực hiện đề tài này chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ hoạt tính của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và so sánh khả năng sinh enzyme chitosanase của vi khuẩn này với một số giống vi khuẩn khác, như chủng DC1, 4DC và HC5. Tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra và lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase có hoạt tính cao. Sau đó chúng tôi tiếp tục thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật bằng hai phương pháp: kết tủa phân đoạn bằng EtOH (cồn) và tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 và đề xuất quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật. Để xác định sơ bộ khả năng sinh hoạt tính chitosanase của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chấm điểm và phương pháp đục lỗ thạch. Chúng tôi sử dụng phương pháp acid dinitrosalicylic để xác định hoạt tính enzyme chitosanase và phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein. trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà nó còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu tố với nhau. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiệm nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis. Chúng tôi thiết kế thí nghiệm bằng cách lập ma trận qui hoạch thực nghiệm, sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm và xử lí kết quả bằng phần mềm NEMRODW. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của giống vi khuẩn này. Tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất cho mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là 480C, nồng độ cơ chất chitosan 0.2%, pH =8. Trong quá trình tiến hành thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật, chúng tôi đã xác định được phân xuất tủa cồn là 40-60% và tủa amoni sunphate là 50-70% là các phân xuất thích hợp để làm sạch enzyme chitosanase từ mẫu giống Bacillus licheniformis. Tuy nhiên trong hai phương pháp đó thì phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sunphate là phương pháp cho kết quả tốt nhất. Phần I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chitosan là polymer hữu cơ được thu nhận bằng cách deacetyl hoá chitin. Chitin có trong động vật thuỷ sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ. Hàm lượng chitin chiếm tỉ lệ khá cao, từ 14-35% so với khối lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải và bảo vệ môi trường…do đó việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu. Chitosan – oligosaccharide (COS) là sản phẩm thuỷ phân của chitosan. Chúng là những chất có hoạt tính sinh học cao như chúng có tác dụng điều hoà huyết áp, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết uric, chống ung thư, trị được bệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng của cây trồng. COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm : COS giúp kích thích tiêu hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư…COS có thể được sản xuất bằng phương pháp hoá học ( thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid HCl đậm đặc ) hoặc bằng phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicenlulase, cellulase để thuỷ phân chitin, chitosan ). Tuy nhiên việc thuỷ phân chitin, chitosan bằng acid đậm đặc có nhiều nhược điểm như chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, hao mòn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt tính không cao. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất COS bằng phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ít gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm có chất lượng tốt. Enzyme chitosanase là một enzyme thuỷ phân liên kết nội phân tử cơ chất chitosan. Enzyme chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra COS. Enzyme chitosanase có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, hay một số thực vật…nhưng enzyme chitosanase thu nhận từ chủng vi khuẩn là có hoạt tính cao hơn cả. Các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp chitosanase lại thường có sẵn trong tự nhiên tại những nơi có xác các loại giáp xác ( tôm, cua…) phân huỷ. Do đó, nếu tận dụng đươc nguồn vi sinh vật tự nhiên này thì có thể tạo ra một phương pháp sản xuất COS rất hiệu quả. Hơn nữa, các vi sinh vật này còn có khả năng sinh sản, phát triển với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng enzyme lớn trong một thời gian ngắn một cách dễ dàng. Mặt khác, môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền. Cho đến thời điểm này ở Việt Nam, những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn rất hạn chế hoặc là hiệu suất thu hồi enzyme từ vi khuẩn còn chưa cao.Với mong muốn góp phần khắc phục các hạn chế còn tồn tại trên, được sự cho phép của khoa Công nghệ sinh học, đồng thời được sự cho phép của khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông gghiệp Hà Nội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis” 1.2. Mục tiêu - Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis. - Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis để thu nhận enzyme chitosan có hoạt tính cao - Lựa chọn được điều kiện thu nhận và tinh chế enzyme chitosanase thô để thu nhận enzyme kỹ thuật : + Kết tủa phân đoạn bằng EtOH + Kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 + Đề xuất quy trình thu nhận chitosanase kỹ thuật. Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU ¬2.1. Chitosan và chitosan oligosaccharide 2.1.1. Cấu trúc và thành phần cấu tạo của chitosan và chitosan oligosaccharide Chitosan là một polysaccharide cao phân tử, mạch thẳng, bao gồm các mắt xích β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1-4)-D- glucosamine (Vũ Công Phong, 2007). Chitosan là dẫn xuất của chitin (Hình 2.1), là một dạng chitin đã bị deacetyl hoá trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được xem là polymer tự nhiên quan trọng nhất nhờ những đặc tính quý báu của nó bao gồm cả tính năng công nghệ và tính năng sinh lý học (Hình2.2). Chitin: Poly (1, 4-2-acetamino-2-deoxy-β-D-glucosamine) Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin Chitosan: Poly (1, 4-2-amino-2-deoxy-ß-D-glucosamine) Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của chitosan Hiện nay, chitosan được sản xuất từ vỏ tôm bằng cả 2 phương pháp hoá học và sinh học. Trong phương pháp sinh học, việc deacetyl hoá chitin còn có thể được xúc tác bởi các enzyme khác nhau bao gồm protease, một số lipase và chitosanase. Enzyme protease thường được sử dụng là papain, bromelain, và các enzyme có nguồn gốc động vật, thực vật, vi sinh vật (Miller, 1959). Tuy nhiên, chitin và chitosan lại có khối lượng phân tử lớn, chuỗi phân tử dài, không hoà tan được trong nước nên đã làm hạn chế đi rất nhiều giá trị sử dụng của chúng. Vì vậy, người ta tiến hành thuỷ phân chitosan bằng phương pháp enzyme hoặc phương pháp hoá học. Phương pháp hoá học sử dụng acid thủy phân cho năng suất rất thấp lại tốn kém nên phương pháp chủ yếu được sử dụng là phương pháp sử dụng enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase phân cắt liên kết β-1,4-glycoside của chitosan tạo ra COS (Hình 2.3). Do đó, về cấu tạo của COS là một chuỗi phân tử được cấu tạo bởi một số đơn vị D-glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến 10 đơn vị GlcN). Chiều dài chuỗi phân tử và mức độ DDA được coi là 2 yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của COS. COS dài hơn hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ung thư, tăng cường miễn dịch… tốt hơn so với các COS ngắn hơn. Sự tăng mức độ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học của COS. Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là điều kiện tiên quyết để sản xuất COS có giá trị cao. Hình 2.3: Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (Tuk-Rai và Jung, 2002) 2.1.2. Tính chất vật lí và tính chất hoá học của chitosan 2.1.2.1. Tính chất vật lí Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, vô định hình. Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH 6) như HCl, acid acetic …tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309-3110C, khối lượng phân tử trung bình 10.000-500.000dalton tùy loại. Với chitosan, DDA là một chỉ tiêu quan trọng nhất ảnh hưởng đến tất cả các đặc tính hoá lí của nó như khối lượng phân tử, độ nhớt, độ hoà tan… Hình 2.4: chitosan 2.1.2.2. Tính chất hoá học của chitosan - Trong phân tử chitin, chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm –NH2 trong các mắt xích D-glucosamine, có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amine. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N- (Zhou và cộng sự, 2007) - Mặt khác chitosan là những polimer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: acid, base, tác nhân oxy hóa và các enzyme thuỷ phân. - Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxy và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+... Tuỳ nhóm chức trên mạch polimer mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau. Ví dụ: phức Ni(II) với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4 (Vũ Công Phong, 2007). 2.1.3. Ứng dụng của chitosan và chitosan oligosaccharide Chitosan và đặc biệt là chitosan oligosaccharide (COS) ngày càng thu hút được sự quan tâm rộng rãi bởi những tiềm năng của chúng trong nhiều lĩnh vực: Công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học, y học và dược phẩm, xử lý nước thải và bảo vệ môi trường… Trong công nghiệp thực phẩm: - Bảo quản rau quả, trái cây, phụ gia thực phẩm... - Sử dụng chitosan, COS để bảo quản một số loại quả tươi (cam, bưởi, dưa chuột, dâu tây, hồ tiêu, cà chua...). Màng mỏng chitosan trên bề mặt quả có tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt được một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận chuyển đi tiêu thụ. - Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sản phẩm vẫn dai, ngon. Phụ gia này được dùng trong chế biến, bảo quản các sản phẩm từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), bột (bún, bánh phở, bánh kem), bánh (bánh ít, phu thê), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống, nước giải khát, sản phẩm sữa... - Bao bì từ chitosan, COS có tính năng đặc biệt, có thể bọc các loài thực phẩm tươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như cá, thịt, làm vỏ nhồi xúc xích có tác dụng kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm mà không độc hại, an toàn cho người, không làm mất màu, mùi vị của sản phẩm được bảo quản (Bough, 1976). Trong nông nghiệp: - Được sử dụng để bao bọc các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. - Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý-sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng. Trong công nghệ sinh học: Chitosan được sử dụng để cố định enzyme, tách protein, tái tạo tế bào, cố định tế bào và sử dụng trong phép sắc kí… Trong y học: - Chitosan, COS được ứng dụng để cầm máu, băng bó vết thương, điều chỉnh hàm lượng cholesterol trong máu, bỏng da, điều chỉnh sự phân giải của thuốc… (Park và cộng sự, 2006). - Từ vật liệu chitosan, các nhà khoa học Phòng Polymer dược phẩm (Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu, chế tạo thành công nhiều sản phẩm hiệu quả cao với giá thành hợp lý như: Thuốc kem Polysamin có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, đặc biệt là chủng nấm Candila albicans, không gây dị ứng và tác dụng phụ, có khả năng cầm máu, chống xưng u, kích thích tái tạo biểu mô và tế bào da để làm mau liền các vết thương, vết bỏng, chóng lên da non và giảm bớt đau đớn cho người bệnh kích thích lên da non, chống sẹo lồi và điều hòa sắc tố da. - Không chỉ dừng lại ở đó, vật liệu chitosan còn được chế tạo thành thực phẩm bổ dưỡng, có tác dụng hạ huyết áp, giảm cholesterol và lipid máu, chống béo phì, vì nó loại bỏ một cách hoàn toàn cholesterol và lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu. Bởi vậy việc bổ sung vật liệu chitosan mà cụ thể là COS vào cơ thể của các bệnh nhân béo phì thì có kết quả tốt. COS là cation dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Cl có trong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp. Vật liệu chitosan còn phòng chống u và ung thư, đặc biệt là tăng cường miễn dịch cho cơ thể, có thể dùng cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV/AIDS bị suy giảm hệ miễn dịch. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide-insulin chitosan kích thích việc tiết ra insulin tuyến tụy nên chitosan đã dùng để điều trị bệnh tiểu đường (Kim và Rajapakse, 2005) Trong xử lý nước thải: Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitosan có thể sử dụng là tác nhân đông tụ hiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các độc tố kim loại nặng. Chitosan được dùng như một chất mang để tách và làm giàu các kim loại nặng trong môi trường nước. Mức độ hấp thu của chitosan với các kim loại nặng thủy ngân, cadimi (Hg, Cd) đạt bão hòa sau 90 phút khuấy. Hg hấp thụ chitosan cao nhất đạt 90%, Cd đạt 41%. Khả năng hấp thụ của chitosan đối với các ion trên đạt cực đại và ổn định ở pH 4-6. Ngoài ra, nó còn có khả năng hấp thụ các chất nhuộm có nồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lí rác thải. Trong ứng dụng đặc biệt này, chitosan tỏ ra có hiệu quả hơn các hợp chất cao phân tử khác được tổng hợp nhân tạo, than hoạt tính. Hơn nữa, nhóm amino (-NH¬¬2) trong chitosan là nhóm hoạt động nhất và nó có thể đóng vai trò là tác nhân hấp phụ hiệu quả. Trong lĩnh vực thẩm mĩ: Trong ngành mỹ phẩm, chitosan, COS được dùng để sản xuất kem chống khô da, kem chống nắng, kem dưỡng mặt và toàn thân nhờ nó có nhóm –NH4+ có thể dễ dàng cố định trên biểu bì của da và liên kết với các tế bào sừng hoá của da. Ngoài ra, chitosan còn được dùng để cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae để lên men, được bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy, làm giấy rửa ảnh, thay hồ tinh bột để hồ vải giúp sợi bền mịn, bóng đẹp, cố định hình in, kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm. Nhờ những ưu điểm trên cho chúng ta thấy sự cần thiết phải phát triển công nghiệp chế biến chitosan, COS. 2.2. Enzyme chitosanase 2.2.1. Khái niệm về enzyme chitosanase Chitosanase có tên gọi đầy đủ, theo danh pháp quốc tế là: chitosan N-acetylglucosaminohydrolase. Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân chitosan bằng cách cắt đứt các liên kết β-1,4-glycoside trừ liên kết giữa các N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc – GlcNAc) và giải phóng ra các chitosan oligosaccharide(COS) . Chitosan + H2O Hoạt tính chitosanase của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn. Hoạt tính chitosanase được biểu thị bằng số đơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm (Choi và cộng sự, 2003). 2.2.2. Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme chitosanase Enzyme chitosanase được tìm thấy từ ở các loài sinh vật khác nhau, bao gồm: Vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, côn trùng và một số loài thực vật. Tuy nhiên, hiện nay nguồn cung cấp enzyme chitosanase chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm này chủ yếu được phân lập từ đất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm, cua…) phân huỷ (Brzezinski và Neugebauer, 2003). 2.2.3. Đặc điểm và cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 2.2.3.1. Khối lượng phân tử Chitosanase cũng giống như đại bộ phận enzyme khác đều có bản chất là protein. chitosanase hầu hết là enzyme ngoại bào, có cấu tạo đơn phân tử. Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30 – 50kDa. Kích thước phân tử protein của enzyme chitosanase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Người ta đã tiến hành thí nghiệm và tính toán khối lượng phân tử của protein chitosanase thu được từ một số loài vi sinh vật khác nhau. Kết quả như Bảng 2.1. Bảng 2.1: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase (Choi và cộng sư, 2003; Miller, 1959; Pelletier và Sygusch, 1992; Tanabe và Morinaga, 2003; Yabuki và cộng sự, 1999; Zhu và cộng sự, 2007) Chitosanase từ Khối lượng phân tử - Bacillus circulans 31 kDa - Streptomyces griceus HUT 6037 34 kDa - Bacillus sp. 41 kDa - Bacillus megaterium P1 43 kDa - Sphingomonas sp. CJ-5 45 kDa - Bacillus sp. KCTC 0377BP 45 kDa - Bacillus cereus 47 kDa 2.2.3.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase Theo Fukamizo và Brezinski (1997) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá. Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để phân cắt. Vị trí phân cắt đó là liên kết β-(1-4)-glycoside giữa các phân tử D-Glucosamine hoặc giữa D-Glucosamine và N-Acetyl-D-Glucosamine. Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào vị trí β-(1-4)-glycoside giữa hai D-Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công vào liên kết này giữa hai phân tử D-Glucosamine và giữa D-Glucosamine với phần N-Acetyl-D-Glucosamine còn lại. Bảng 2.2 thể hiện vị trí liên kết bị tấn công bởi một số chitosanase Bảng 2.2: Kiểu phân cắt của các loại chitosanase Chitosanase Kiểu phân cắt Loại I -Bacillus pumilus BN-262 -Penicillium islandicum Streptomyces sp. N174 Loại II -Bacillus sp. No 7-M Loại III -Streptomyces griseus HUT 6037 -Bacillus circulans MH-K1 -Nocardia orientalis -Bacillus circulans WL-12 : GlcNAc : GlcN Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến đổi cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho proton, trong khi đầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C-1 của phân tử đường khử tại vị trí xúc tác. Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có khoảng cách 13,8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å. Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong Hình 2.5 Hình 2.5: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (thin-layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng ra COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân tử. Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3. Còn (GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ. (GlcN)6 chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4 nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều, [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2]. Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4. Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu. Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn (Choi và cộng sự, 2003). 2.3. Giới thiệu về vi khuẩn ưa nhiệt 2.3.1. Vi khuẩn 2.3.1.1. Khái niệm Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có nhân nguyên thuỷ. 2.3.1.2. Hình thái và kích thước Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính của phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0.2-2µm, chiều dài cơ thể khoảng 2.0-8.0µm. Hình thái vi khuẩn rất đa dạng : hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có cuống… 2.3.1.3. Phân loại Theo Vũ Thị Minh Đức (2001), có thể phân loại vi khuẩn theo hai tiêu chí sau: -Dựa vào hình dạng tế bào vi khuẩn chia thành: +Cầu khuẩn (coccus). Tế bào có hình tròn. Trong cầu khuẩn gồm có: Đơn cầu khuẩn, Song cầu khuẩn, Liên cầu khuẩn, Tứ cầu khuẩn, Tụ cầu khuẩn. +Trực khuẩn (Bacillus): Tế bào có hình que, cũng có các dạng đơn, đôi, chuỗi. +Phẩy khuẩn (Vibrio): Tế bào có hình dấu phẩy. +Xoắn khuẩn (Spiilum): Tế bào từng xoắn lại. Ngoài ra còn gặp vi khuẩn hình sao, hình khối vuông, hình khối tam giác. -Dựa vào phản ứng với chất hoá học vi khuẩn được chia thành 2 loại: +Vi khuẩn Gram (+). +Vi khuẩn Gram (-). 2.3.2. Khái niệm vi khuẩn ưa nhiệt Nhiệt độ phát triển là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng của vi sinh vật. Người ta chia nhiệt độ phát triển của vi sinh vật theo các chỉ tiêu: Nhiệt độ tối đa (t0 max), nhiệt độ tối thiểu (t0 min), nhiệt độ tối thích (t0opt). Dựa vào nhiệt độ phát triển, theo Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu (1978), thì vi sinh vật được chia làm các nhóm sau: -Vi sinh vật ưa lạnh: Bao gồm các vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt độ lạnh từ 00-200C. -Vi sinh vật ưa ấm: Bao gồm các vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ trung bình. Nhịêt độ tối ưu cho chúng phát triển là 250-360C. -Vi sinh vật ưa nhiệt: Bao gồm các vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, thường từ 42-690C, một số vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt ở 800-1100C. Tuy nhiên, sự phân chia các nhóm vi sinh vật trên cơ sở nhiệt độ phát triển của chúng chỉ là tương đối. Một số vi sinh vật ưa ấm sau quá trình thích nghi có thể trở thành vi sinh vật chịu nhiệt . 2.3.3. Cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật Cơ chế chịu nhiệt của vi sinh vật đến nay vẫn còn được các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu. Đặc biệt ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, người ta thấy rằng cơ chế chịu nhiệt ở vi sinh vật là tập hợp của nhiều yếu tố liên quan đến cấu trúc của màng tế bào, thành phần và cấu trúc protein, enzyme, tính di truyền của màng tế bào vi sinh vật. Đa số các vi sinh vật chịu nhiệt có thành tế bào dày, có độ bền cơ học cao hơn các loại vi sinh vật khác. Thành phần protein và lipid của màng tế bào cũng có vai trò quyết định đến tính chịu nhiệt của vi sinh vật. Ribosom là nhà máy tổng hợp protein của tế bào, bản chất protein của ribosom và khả năng chịu nhiệt của nó do các gen chịu nhiệt trong bộ gen của vi sinh vật điều khiển. Nhiệt độ biến tính protein của ribosom càng cao thì khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật càng cao (Lê Gia Huy và cộng sự, 1997). 2.3.4. Nhận diện vi khuẩn 2.3.4.1. Hình thái khuẩn lạc Bao gồm màu sắc, hình dạng , kích thước khuẩn lạc. Nó đặc trưng cho từng nhóm vi khuẩn. 2.3.4.2. Nhuộm Gram Dựa vào sự bắt màu của vi khuẩn đối với thuốc nhuộm mà chia thành 2 dạng : Gram (-) và Gram (+). 2.3.4.3. Hình thái tế bào vi khuẩn Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ta sẽ thấy được hình dạng tế bào vi khuẩn. Dựa vào đó mà có thể phân vi khuẩn thành các dạng: Hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn… 2.3.4.4. Khả năng di động Có loài vi khuẩn không di động, một số ít di động, một số khác lại di động rất mạnh. Để nhận biết được khả năng này, ta quan sát tiêu bản sống của vi khuẩn dưới kính hiển vi sẽ nhìn thấy một cách chính xác. Tuy nhiên, ta cũng có thể quan sát hình thái khuẩn lạc để dự đoán được khả năng di động của vi khuẩn: Những khuẩn lạc có viền nhẵn là những tế bào vi khuẩn không có tiên mao nên không có khả năng di động, những khuẩn lạc có viền không nhẵn là tế bào vi khuẩn có tiên mao nên có khả năng di động (Trần Thị Thanh, 1995). 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật 2.4.1. Thành phần môi trường Các chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật là bất kỳ chất nào được vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Thành phần hoá học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa và vi lượng. Khi chọn lựa môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý đến thành phần chất lượng và sự tương quan về số lượng giữa các cấu tử trong môi trường (Lương Đức Phẩm, 2004). - Nguồn Cacbon: Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Muốn thu được enzyme cao thì phải có cơ chất để cảm ứng giúp vi sinh vật có thể sinh tổng hợp enzyme để thuỷ phân nguồn cơ chất đó. nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitosanase là chitosan, chitin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004). - Nguồn Nitơ: Nguồn nitơ dễ hấp thụ với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Nguồn nitơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone. Nguồn acid amin của các loại vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau. - Nguồn khoáng: Sự có mặt của các nguyên tố đa lượng và vi lượng ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp enzyme. Phospho, lưu huỳnh rất cần cho vi sinh vật vì chúng tham gia vào thành phần của những chất quan trọng như nucleotid, protein, enzyme, vitamin… phospho còn tham gia vào nhiều phản ứng trao đổi chất của tế bào. Các nguyên tố như sắt, kẽm, đồng, coban… tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng rất cần thiết cho vi sinh vật để cấu tạo nên một loại enzyme (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998). 2.4.2. Điều kiện lên men Với phương pháp lên men chìm thì các điều kiện như nhiệt độ, pH, chế độ thoáng khí, tốc độ lắc, áp suất thẩm thấu đều có ảnh hưởng nhất định đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Nhiệt độ nuôi cấy là một yếu tố quan trọng trong quá trình lên men. Nó ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình sinh trưởng, phát triển và sản xuất sinh khối của vi sinh vật. Còn pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Ngược lại, trong quá trình nuôi cấy, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể làm thay đổi pH môi trường, làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Chính vì vậy, việc lựa chọn và duy trì giá trị này trong suốt quá trình nuôi cấy là rất quan trọng. Mỗi loại vi sinh vật đều có một giá trị hoặc khoảng giá trị nhiệt độ, pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme (Lương Đức Phẩm, 2004). 2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tiềm năng ứng dụng rộng lớn chitosanase đang được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu sản xuất rất nhiều trên thế giới. Rất nhiều nước đang tiến hành nghiên cứu quá trình sản xuất enzyme chitosanase như: Nhật, Canada, Mỹ, Hàn Quốc…Nhưng quy trình sản xuất chitosanase hiện nay chưa có quy mô công nghiệp, chỉ tiến hành nghiên cứu trong viện và các trường đại học. Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới Đề tài nghiên cứu Kết quả Tác giả và đơn vị tiến hành Nghiên cứu sinh tổng hợp và tinh sạch, xác định đặc tính enzyme chitosanase từ chủng Bacillus megaterium P1 Xác định ba loại enzyme sinh tổng hợp có khả năng thuỷ phân chitosan Enzyme có khối lượng 39.5 kDa, pH tối thích 4.5-6.5, và nhiệt độ 450C, hai enzyme còn lại có khối lượng 43kDa và 22 kDa A. Pelletieer and J. Sygusch (1990), thuộc trường đại học Sherbrooke.Canada Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng Bacillus subtilis TKU007 Được phân lập từ đất ở Đài Loan, enzyme có khối lượng là 7, enzyme bền ở nhiệt độ 25-300C, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là ở 370C và bị bất hoạt ở 600c Yeon Jin Choi, Eun jung Kim, Zhe Pion (2003), Đại học quốc gia Gyeongsans. Hàn Quốc Tinh sạch và xác định tính chất của chitosan và chitosanase từ chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. TKU015 với việc sử dụng vỏ tôm như là một cơ chất Hoạt tính tốt nhất của chitosan và chitosanase được xác định ở pH từ 4-6. Nhiệt độ tối thích là 500C. Duy trì hoạt tính được từ 250C-400C và bất hoạt ở 700C San-Lang Wang, pe-Yi Ye (2007), Đại học Tamkang Các chủng vi sinh vật được phân lập, tuyển chọn từ tự nhiên :Môi trường đất, môi trường nước, từ một số sản phẩm hoặc từ bộ giống có sẵn. Nhiều đề tài nghiên cứu về điều kiện thu nhận cũng như tinh sạch enzyme và khảo sát các điều kiện phản ứng cũng như các nhân tố ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme chitosanase được các nhà khoa học tiến hành. Hơn thế nữa với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử đã tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng sịnh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao. Tuy nhiên hiện nay, phương pháp cải biến di truyền bằng gây cảm ứng và chọn lọc kinh điển để cải tiến các chủng vi sinh vật đã không còn hấp dẫn vì tốn thời gian và giá thành lại cao. Việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp không chỉ tạo ra những chủng vi sịnh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao mà còn tạo ra cho các enzyme đó những đặc tính vượt trội. Như việc tạo ra chủng Bacillus sp.strain CK4 có khả năng sinh tổng hợp chitosanase chịu nhiệt. Enzyme chitosan chịu nhiệt này gồm 242 aminoacid, có khối lượng phân từ là 30 kDa. Người ta nhận thầy chuỗi polypeptide của nó có tới 76% giống chuỗi chitosanase thu nhận từ Bacillus subtilis. Chitosanase này có khả năng chịu nhiệt, thời gian bán huỷ của nó là 90 phút ở 800C. Nhờ đặc tính này mà nó rất có ích trong công nghiệp. 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Các nghiên cứu về enzyme chitosanase ở nước ta cho đến thời điểm hiện nay còn rất ít, hầu hết các nghiên cứu còn dừng ở những giai đoạn ban đầu mà chưa có điều kiện đi sâu hơn và còn chậm hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới. Hiện nay ở nước ta mới có một số đề tài nghiên cứu về chitosan: -“ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griceus” (Đại học thuỷ sản nha trang) -“Biểu hiện và xác định một số đặc tính của chitosanase tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus circulans MH-KL” ( Đại Học Bách Khoa Hà Nội) -“Bước đầu xây dựng quy trình công nghệ enzyme thuỷ phân chitin/chitosan bằng enzyme chitinase/chitosanase “(Viện Công Nghệ Sinh Học) -“ Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên cấu trúc phân tử enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus circulans MH-KL” (ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM) Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.l. Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu giống vi khuẩn Bacillus lícheniformis do bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh - Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội phân lập từ mẫu nước lấy từ mẫu nước lấy từ suối nước nóng Kênh Gà – Ninh Bình. 3.1.2. Địa điểm Nghiên cứu đề tài được tiến hành tại bộ môn Hoá sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm - Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 3.1.3.1. Môi trường cấy truyền, hoạt hoá và nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (môi trường LB-Agar) Môi trường hoạt hoá và nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Hàm lượng(%) Giống môi trường cấy truyền, chỉ thay Agar bằng dung dịch chitosan 0.2% Peptone 1% Cao nấm men 0.5% NaCl 0.5% Agar 2% nước cất pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút 3.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính của vi khuẩn Thành phần Hàm lượng (%) Agar 2% Dung dịch chitosan 0.2% pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Bảo quản và giữ giống - Sau khi tiếp nhận, các mẫu giống vi khuẩn được cấy truyền vào môi trường thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 48oC để giữ giống. Sau khi các giống đã mọc tốt, bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 – 4oC, sau 2 - 3 tuần phải cấy truyền lại một lần. Bảo quản giống là khâu hết sức quan trọng. 3.2.2. Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis Sử dụng môi trường thử hoạt tính. Cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng. Những mẫu giống có hoạt tính chitosanase cao sẽ được nghiên cứu tiếp ở điều kiện nuôi cấy thích hợp. 3.2.3. Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính Môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác vô trùng có thể tích 250 ml. Cấy mẫu giống đã hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống nghiệm với thể tích môi trường hoạt hoá 5ml) vào môi trường nuôi cấy ở chế độ vô trùng. Quá trình nuôi cấy được tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200 rpm, 48oC trong thời gian 1 ngày 3.2.4. Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp đục lỗ thạch) Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy. Dịch enzyme thu được sẽ được đem đi phân tích hoạt tính enzyme để tiếp tục tuyển chọn ra mẫu giống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao. Đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 22h sau đó quan sát, đo đường kính vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc các mẫu có hoạt tính tốt để nghiên cứu tiếp. 3.2.5. Chuẩn bị cơ chất chitosan Cân 2,35g chitosan (>85%) dạng vảy ngâm trong 500ml dung dịch acid acetic 1% trong 48h. Sau đó ly tâm loại bỏ cặn không tan, rồi lên thể tích 1000ml bằng nước cất. Dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N chỉnh pH của dung dịch chitosan về pH 8, ta được dung dịch chitosan 0,2%, pH = 8 để sử dụng. 3.2.6. Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các Oligosaccharide có đầu chứa đường khử D-glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic xác định sự có mặt của nhóm (C = O) trong đường khử, oxy hoá nhóm aldehyt trong đường, đồng thời 3,5-dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3-amino,5-nitrosalicylic acid trong môi trường kiềm. CHO- oxh nhóm COO- 3,5 – dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acid Sulfite được bổ sung vào phản ứng để hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vì oxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.Theo trình tự phản ứng, một phân tử đường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS (Wang, 2007). Xác định hoạt độ enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic (DNS) (Nguyễn Văn Mùi, 2001). Nguyên liệu: • Tác nhân phản ứng DNS gồm: o Dinitrosalicylic acid: 10 g o Phenol: 2 g o Sodium sulfite: 0.5 g o Sodium hydroxide: 10 g o Thêm nước cất đến : 1lít • Potassium sodium tartrate solution, 40% • Tiến hành: - Cho 3ml DNS + 3ml glucose vào ống nghiệm (đậy kín) - Đun ở 90oC trong 5 - 10phút → dung dịch có màu nâu đỏ - Thêm 1ml potassium sodium tartrate (Kali natri tartrat) 40% vào phản ứng để ổn định màu - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng - Đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 575nm (A575). Dựng đường chuẩn Glucosamine: Pha dãy glucosamine chuẩn từ 0; 0,5; 1,0; 1,5; …9,0; 9,5; 10mg trong 1ml. Cho 3ml dung dịch glucosamine chuẩn vào một ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi 90oC trong 5phút. Thêm 1ml dung dịch potassium sodium tartrate 40%. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 575nm (A575). Vẽ đường chuẩn glucosamine với trục tung là độ hấp thụ quang học A575, trục hoành là nồng độ glucosamine. Chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme: Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thí nghiệm, một ống đối chứng. Lấy 2ml dịch enzyme cho vào mỗi ống, ở ống đối chứng cho thêm 100μl dung dịch NaOH 10N để bất hoạt enzyme. Sau đó, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch chitosan 0,2%. Đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 30phút. Sau đó, nhỏ 100 μl NaOH 10N vào ống thí nghiệm để dừng phản ứng. Từ mỗi ống này lấy ra 3ml rồi thêm vào 3ml DNS, đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt 90oC trong 5 - 10phút. Sau đó, nhỏ vào mỗi ống 1ml dung dịch Kali natri tartrate 40%. Rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và đo A575. - Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần. - Kết quả hoạt tính enzyme được tính theo phương trình đường chuẩn. Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân chitosan để giải phóng ra 1μmol đường khử trong thời gian 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn của phương pháp phân tích. Từ định nghĩa ta có công thức tính hoạt tính enzyme chitosanase là: Hoạt tính = X*4*1000/30*180*2 Trong đó : X là nồng độ glucosamine tính theo đường chuẩn (mg/ml) 4 là tổng thể tích dịch sau phản ứng (2ml dịch enzyme và 2ml dung dịch chitosan) 30 là thời gian phản ứng 180 là khối lượng phân tử glucosamine 2 là thể tích enzyme trong phản ứng. 3.2.7. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của mẫu giống vi khuẩn được tuyển chọn 3.2.7.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc Cấy trang mẫu giống vi khuẩn đã được tuyển chọn lên đĩa thạch chứa môi trường cấy truyền, sau đó nuôi trong tủ ấm 480C, sau 22h đem quan sát hình thái khuẩn lạc. 3.2.7.2. Quan sát hình thái tế bào Tiến hành nhuộm Gram, được thực hiện như sau: - Phiến kính được rửa sạch và làm khô. Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vừa đủ tế bào vi sinh vật rồi dàn đều trong giọt nước. - Hong khô và cố định vết bôi - Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian 1% hay tím kết tinh (1 – 2 phút), để nghiêng cho thuốc nhuộm thừa cháy xuổng. - Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi (1 – 2 phút) - Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol - Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2 phút. - Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu. Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G¬¬- bắt màu đỏ. 3.2.8. Xác định đường cong sinh trưởng của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis Tiến hành nuôi mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, lắc 200 rpm. Cứ sau 2h lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620). 3.2.9. Chọn lựa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitosanase hoạt tính cao Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn. Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng rẽ nhưng chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốt nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sự tác động tương tác lẫn nhau. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện của tổng hợp các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn. Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào các tài liệu đã công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôi cấy gồm ba yếu tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môi trường trong khoảng [7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C]. Từ phương trình hồi qui có dạng: Y =b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1X1 + b22X2X2 + b33X3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 Trong đó: X1 - biến số mã hoá của biến thực Z1-nhiệt độ nuôi cấy (T0C), khoảng khảo sát [40-560C], mức tâm: 480C, bước nhảy: 40C. X2 - biến số mã hoá của biến thực Z2-pH môi trường nuôi cấy, khoảng khảo sát [7-9], mức tâm: 8, bước nhảy: 1. X3 - biến số mã hoá của biến thực Z3-nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy (%), khoảng khảo sát [0.1-0.3%], mức tâm: 0.2%, bước nhảy: 0.1%. Y – hàm mục tiêu, là hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml) b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phương trình hồi quy Chúng tôi xây dựng được ma trận qui hoạch thực nghiệm được thể hiện trong Bảng3. Bảng 3.1. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm) Thí nghiệm số Z1 (Nhiệt độ,0C) Z2 (pH) Z3(Nồng độ cơ chất, %) 1 56.0 8 0.2 2 40.0 8 0.2 3 52.0 9 0.2 4 44.0 7 0.2 5 52.0 7 0.2 6 44.0 9 0.2 7 52.0 8 0.3 8 44.0 8 0.1 9 52.0 8 0.1 10 48.0 9 0.1 11 44.0 8 0.3 12 48.0 7 0.3 13 48.0 8 0.2 Cách tiến hành: - Hoạt hóa mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis vào môi trường đã chuẩn bị theo các công thức đã trình bày. - Nuôi cấy trong 24h, tốc độ lắc 200rpm. - Mỗi công thức được lập lại 3 lần. 3.2.10. Phương pháp xác định hàm lượng protein - Ly tâm dịch nuôi cấy 6000rpm, ở 40C, thu dịch enzyme thô. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch enzyme theo phương pháp Bradford (Nguyễn Văn Mùi, 2001). Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trong dung dịch acid. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein tương tác với nhóm kị nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện. Cách pha Coomassie Brilliant Blue G-250: Hoà tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50ml cồn 95%. Bổ sung 100ml acid phosphoric 85% và 450ml nước cất. Lọc dung dịch bằng giấy lọc, bổ sung 100ml glycerine. Đưa thể tích lên 1000ml. Sử dụng sau 24h. Tiến hành: + Ống thí nghiệm: 0,1ml dung dịch protein cần xác định, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn đều. + Ống đối chứng: 0,1ml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn đều. + Đem đo A ở bước sóng 595nm (A595) sau 2 phút đến 1h. Mỗi mẫu được làm lặp lại 2 lần. + Tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm theo đường chuẩn. Dựng đường chuẩn protein: Pha dãy protein từ 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6mg/ml. Tiến hành phản ứng với CBB G-250 theo thứ tự đã trình bày. Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 595nm (A595). 3.2.11. Thu nhận enzyme thô 3.2.11.1. Loại sinh khối của dịch nuôi cấy Sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn kết thúc, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 6000 rpm ở 40C. Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và thu lại phần dịch trong. 3.2.11.2. Cô đặc dung dịch enzyme thô Dịch enzyme thô thu được sẽ được chia đều vào các bình thuỷ tinh rồi để đóng đá qua đêm. Sau đó tiến hành cô đặc dịch enzyme bằng phương pháp sấy đông khô. Phương pháp này không gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme do được thực hiện ở nhiệt độ rất thấp (-500C) 3.2.11.3. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn cồn Tiến hành tủa phân đoạn bằng cồn ethylic lạnh. Cồn làm mất vỏ hydrat bao quanh các phân tử protein, làm cho các phân tử protein đông tụ lại với nhau dưới dạng tủa. Làm lạnh cồn tuyệt đối, làm lạnh dung dịch enzyme cần tủa. Lấy 200 ml dung dịch enzyme cô đặc đến 50 ml cho vào cốc thuỷ tinh, cho từ từ 30 ml cồn đã làm lạnh vào dung dịch enzyme này, khuấy đều, lại làm lạnh 15 - 30 phút. Sau đó, ly tâm lạnh ở tốc độ 6000v/ph trong 15phút, thu cặn tủa. Đánh dấu phân đoạn tủa 0 - 30%. Cặn thu được hoà tan trong đệm phosphate pH 6,0 ta được dịch enzyme phân đoạn 0 - 30%. Còn dịch trong thu được tiếp tục cho thêm cồn đã làm lạnh để đạt 40% cồn. Tiến hành tương tự như trên cho đến phân đoạn 80 - 90%. Các tiểu phần thu được tiến hành xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein. Qua kết quả trên ta sẽ xác định được hoạt tính enzyme cao nhất ở phân đoạn nào. 3.2.11.4. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn amoni sulphat Canh trường vi sinh vật sau khi nuôi cấy đem li tâm để thu lấy dịch trong. Lấy 200ml đem cô đặc sau đấy đem cô đặc còn 50ml cho vào cốc thuỷ tinh, sau đó bổ sung muối amoni sunphat ở các nồng độ khác nhau. Khối lượng amoni sunphat được tính theo công thức: M = a.V/1000 Trong đó: V là thể tích enzyme đem kết tủa a là giá trị tra bảng khối lượng được trình bày ở phần phụ lục Thời gian kết tủa 30 phút, trên máy khuấy từ ở 00C. Trong quá trình cho muối vào phải cho từ từ để tránh hiện tượng biến tính protein cục bộ, sau đó cho enzyme vào tủ lạnh để qua đêm, sau đó đem li tâm thu tủa ở 40C, vận tốc 9000 vòng/phút trong 30 phút. Tủa thu được đem hoà tan trong đệm axetat 0,2M pH = 5. Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein ở các phân đoạn. 3.2. 12. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả Các kết quả thu được sẽ được xử lí bằng phần mềm Excel, SAS, NEMRODW. Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng. Qua quá trình xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis trên môi trường thử hoạt tính, chúng tôi thấy vòng phân giải cơ chất rộng và sáng chứng tỏ mẫu giống vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase cao. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn này và so sánh với các chủng giống vi khuẩn khác bằng cách sử dụng phương pháp đục lỗ thạch để thử hoạt tính enzyme chitosanase. Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis Sau khi tiến hành hoạt hoá, nuôi cấy mẫu vi khuẩn trên, chúng tôi ly tâm dịch nuôi cấy để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy có chứa enzyme thô của từng mẫu. Các mẫu enzyme thô này được thử hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch được tiến hành như sau: đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 24h. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 và Hình 4.2. Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác Mẫu DC1 4DC HC5 Bacillus licheniformis Hiệu số đường kính vòng Phân giải của Chitosanase (cm) 3.0 2.6 2.8 3.5 Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hoạt tính của enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn Baccilus licheniformis là cao so với các mẫu giống vi khuẩn khác đã từng được nghiên cứu. Những mẫu giống vi khuẩn như DC1, 4DC, HC5 thì hiệu số đường kính vòng phân giải của chitosanase chỉ vào khoảng 2,5-3cm, còn giống vi khuẩn Bacillus licheniformis hiệu số đường kính vòng phân giải đạt 3.5cm. Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống Bacillus licheniformis Để khẳng định chắc chắn mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh ra enzyme chitosanase có hoạt tính cao, chúng tôi tiếp tục xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis, đồng thời so sánh hoạt tính enzyme chitosanase với 3 mẫu giống DC1, 4DC, HC5 ( là những mẫu giống đã được nghiên cứu để thu nhận enzyme chitosanase ). Enzyme thô của các mẫu giống vi khuẩn này được chuẩn bị và tiến hành xác định hoạt tính như đã mô tả trong phần phương pháp. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1 Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu Mẫu Hoạt tính (U/ml) Bacillus licheniformis 1.23 DC1 1.10 4DC 1.05 HC5 0.89 Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu Qua Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1 cho thấy mẫu giống vi khuẩn có hoạt tính enzyme chitosanase cao nhất là mẫu Bacillus licheniformis (1.23 U/ml), tiếp theo là mẫu DC1 (1.10), mẫu 4DC (1.05 U/ml) và mẫu HC5 (0.89 U/ml). Qua tham khảo nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới thì với hoạt tính enzyme chitosanase thô của dịch nuôi cấy lớn hơn 1U/ml là rất khả quan, ví dụ như hoạt tính của enzyme chitosanase sinh ra bởi vi khuẩn Bacillus cereus là 1.34 U/ml (Piza và cộng sự, 1999)… Trên cơ sở kết quả thu được trên, chúng tôi thấy rằng mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh ra enzyme chitosanase có hoạt tính cao, nên chúng tôi quyết định chọn mẫu giống vi khuẩn này để tiếp tục nghiên cứu. 4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis 4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Sau khi cấy trang mẫu giống Bacillus licheniformis và nuôi ở nhiệt độ 480C trong 24h, hình thái khuẩn lạc quan sát được như Hình 4.3, Hình 4.4 Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis Khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis đầu tiên có màu trắng sau thấy có váng tím trên bề mặt, khuẩn lạc tròn, nhăn, thường mọc thành cụm 4.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần, hình thái tế bào quan sát được như Hình 4.5. Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Qua tiêu bản nhuộm Gram, ta thấy tế bào có hình que, bắt màu thuốc nhuộm safranin (màu tím). Như vậy giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram (+). Và là loại vi khuẩn có khả năng di động. 4.3. Chọn lựa thời gian tiếp giống và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis 4.3.1. Thời gian tiếp giống Việc xác đinh cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ cho ta biết sự biến đổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh (tính theo hàm log) được thể hiện qua các pha, từ đó giúp chúng ta lựa chọn được đâu là thời điểm tiếp giống thích hợp nhất. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở 480C, tốc độ lắc 200 rpm, cứ 2h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học (A620) trong 36h. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Đồ thị 4.2 Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian Thời gian (h) A620 0 0.042 2 0.065 4 0.104 6 0.135 8 0.189 10 0.358 12 0.582 14 0.653 16 0.866 18 0.967 20 1.032 22 1.105 24 1.118 26 1.104 28 1.1 30 1.091 32 1
Posted on: Wed, 18 Sep 2013 14:34:05 +0000
Trending Topics
Recently Viewed Topics
© 2015